【實驗目的】

（1）掌握藍白斑篩選的原理。

（2）掌握藍白斑篩選鑒定重組DNA的方法和操作步驟。

【實驗原理】

藍白斑篩選是重組子篩選的1種方法，是在抗生素篩選基礎上的第2次篩選，是根據載體的遺傳特征篩選重組子。基因工程使用的載體常帶有1個大腸杆菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了1個多克隆位點，它并不破壞閱讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體适用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而産生的LacZ 細菌在誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的作用下，在生色底物X-gal存在時産生藍色菌落，因而易于識别。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點後，會産生無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。

【實驗材料、試劑及儀器】

1．實驗材料

實驗29中轉化後加入800μL LB液體培養基，混勻後37℃振蕩培養1h的大腸杆菌。

2．實驗試劑

（1）X-gal：将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/mL，不需過濾滅菌，分裝成小包裝，避光貯存于－20°C。

（2）IPTG：取2g IPTG溶于8mL雙蒸水中，再用雙蒸水補至10mL，用0.22μm濾膜過濾除菌，每份1mL，貯存于－20°C。

（3）TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0），121℃高壓滅菌20min，備用。

（4）抗生素溶液：50mg/mL氨苄青黴素或10mg/mL卡那黴素。

3．實驗儀器

超淨工作台（每8人1台）

恒溫水浴鍋（每4人1台）

恒溫搖床（全班1台）

台式低溫高速離心機（每4人1台）

錐形瓶、玻璃塗棒、培養皿（若幹）

1．5mL無菌離心管（若幹）

20μL、200μL無菌吸頭（若幹）

20μL、200μL微量移液器（每2人1套）

【實驗步驟】

（1）待LB固體培養基冷卻至50°C，加入一定濃度的相應抗生素（pUCm-T載體則加入100μg/mL氨苄青黴素；pET28a載體則加入100μg/mL卡納黴素），倒入培養皿，凝固後4℃保存。

（2）在預制的含一定量抗生素的LB瓊脂平闆上，加40μL20mg/mL X-gal和4μL 200mg/mL IPTG溶液，并用滅菌玻璃塗棒（酒精燈上燒後冷卻）均勻塗布于瓊脂凝膠表面。

（3）将适當體積（200μL）已轉化并培養的感受态細胞均勻塗在上面的培養皿上，将培養皿放置37℃培養箱中30min，至液體被吸收。

（4）倒置培養皿于37℃培養12～16h，至出現菌落，其中白色菌落為重組DNA質粒。

【典型實驗結果分析】

理想實驗結果（見圖13.3）經12～16h培養後，培養皿上生長着很多白色菌落和藍色菌落，白色菌落為DNA重組子，藍色菌落為空載體。

【注意事項】

（1）白色菌落中的重組質粒内插入片段是否是目的片段需通過鑒定。

（2）整個操作要注意避免外來DNA的污染。

圖13.3　重組DNA的藍白斑篩選結果及示意圖

（3）插入的PCR片段較短（小于500bp），且插入片段沒有影響lacZ基因的閱讀框時，平闆培養基上出現的菌落有可能呈現藍色。

（4）抗生素要在培養在冷卻至50～60℃左右才添加，否則會引起抗生素失活。

（5）IPTG和X-gal要塗均勻。a