上期我們介紹了空間轉錄組冰凍組織樣本的制備，那麼這期就來聊一聊空間轉錄組FFPE樣本的那些事兒。FFPE樣本常用于儲存臨床上的病理組織，是珍貴的醫學研究材料，但由于FFPE樣本固定時福爾馬林的使用和保存時間久等原因，導緻核酸存在不同程度的降解，使得研究基因表達頗為棘手。10x Genomics經過探索推出了Visium FFPE空間基因表達解決方案，不僅突破了這個障礙，能從 FFPE 樣本中以高靈敏度和高特異性分析相關基因的表達，而且還能結合空間位置信息，對整張組織切片進行分析，從而真正地實現在形态學背景下的探索性發現。

Visium For FFPE實驗原理

Visium FFPE空間基因表達是基于探針雜交的原理，使用的載玻片與之前的冰凍切片空間基因表達解決方案類似，在一張玻片上面包含4個捕獲區域，每個區域包含5000個spots，根據組織類型的不同，每個spot約覆蓋1-10個細胞，每個spot包含數百萬的探針，每個探針上帶有spatial barcodes，用來标記空間位置。FFPE解決方案針對靶mRNA設計了兩段連續的特異性探針，覆蓋人18,000個基因、小鼠20,000個基因，試劑盒中包含有LHS(左端探針)和RHS（右端探針）。左端探針包含有read 2結構，右端探針包含有polyA結構。探針被雜交後，隻有靶mRNA的兩段連續探針同時被雜交，探針才會進行連接，若隻有一段被捕獲，後續将無法完成建庫，有效降低假陽性。之後mRNA模闆徹底降解掉，僅存的探針序列從組織原位中被透化出來，組織透化後，被連接的成對探針與芯片上包含空間barcode、UMI和poly(dT）序列的引物序列捕獲，并且空間barcode和UMI序列被延伸到成對探針序列上。最後攜帶空間barcode的探針序列用于進行測序文庫構建和測序。

Visium For FFPE實驗流程

1. 将FFPE組織切片放置在Visium基因表達芯片上，進行進行組織學成像（H&E用于形态學背景，IF用于蛋白質共表達檢測）；

2. 用RTL探針集在組織中靶向雜交和連接，并用RNase酶處理和透化，然後與芯片上的捕獲探針結合延伸；

3. 制備測序文庫，獲得測序數據後，通過空間條形碼将帶有條形碼的文庫映射回捕獲區域上的特定數據點；

4. 使用可視化軟件，将空間分辨的基因表達數據與組織切片的高分辨率顯微鏡圖像相疊加進行分析和呈現。

Visium For FFPE數據對比

FFPE樣本與新鮮組織樣本數據對比：

A.對小鼠腦FFPE與新鮮冷凍組織分别進行Visium分析發現，兩種組織檢測到的基因具有高度相關性，顯示了Visium對FFPE樣本的可靠性和高靈敏度；

B.Hpca空間mRNA表達數據顯示，在新鮮冷凍和FFPE樣品的海馬中均有該基因表達，與已知的表達模式一緻，表明了Visium對FFPE的特異性；

C.對小鼠大腦FFPE樣本中連續切片，用Visium FFPE處理後，在聚類和UMIs檢測中顯示出高重現性。

使用Visium FFPE 空間基因表達解決方案來檢測人乳腺癌FFPE樣本中約18000個基因：

A.H&E染色圖像，覆蓋了來自FFPE的WTA數據；

B.總基因；

C.聚類分析；

D.關鍵乳腺癌基因（ERBB2 (HER2)，孕酮受體(PGR)和雌激素受體(ESR1)）的表達水平和空間組織位置分布。

Visium For FFPE送樣要求

樣本制備

1. 取材

材料選擇時須盡可能不損傷所需要的部分，刀要銳利，動物組織取材建議灌流後取材，沖去過多血液。盡可能割取生活着的組織塊，并随即投入固定液。材料應該小而薄，一般厚度不超過2mm，大小不超過6.5×6.5mm2。

2. 固定和水洗

取好的組織塊用10%緩沖中性福爾馬林（甲醛）液固定24~48h。随後用流水沖洗，大塊組織一般沖洗24小時，小塊組織一般沖洗2—10小時。

3. 脫水

在有蓋瓶中，從30％乙醇開始，經過50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水。一般各級乙醇中放置45min到1h。

4. 透明

将組織塊先經純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進入純二甲苯。透明時間應由組織大小而定，—般各級停留時間在30min至2h，在純二甲苯中應更換2次，總時間則以不超過3h為宜。

5. 透蠟

須在恒溫箱中進行， 恒溫箱的溫度調節至高于石蠟熔點3度，使經過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應處理2～3次，透蠟的時間依材料性質而定，一般每次需15～30min。

6. 組織包埋

準備好紙盒，将熔蠟倒入盒内，迅速用預溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟凝固後立即将紙盒按入水中，使其迅速冷卻凝固，30min後取出。

樣本需求

1. 組織區域大小：< 6.5×6.5mm2，較大的組織将被切除。

組織樣本太大的話，可以根據不同病變區域分為多個樣本。例如，腫瘤組織可以分為中心/邊緣/正常組織進行切片觀察。另外，研究三維結構可能要做連續的切片，看三維結構的共性可能要找到不同組織進行連續切片。

2. 切片厚度：5μm。

FFPE樣本切片厚度一般為5μm（區别于冰凍組織樣本的10μm），切片樣本大小不宜超過6.5mm × 6.5mm（載玻片的大小），超出的部分無法被捕獲到，反而可能會影響其他樣本空間信息。

3. 低溫寄送樣本（冰袋）。

Visium For FFPE樣本質控

1. H&E 染色，觀察組織形态是否完整，輔助選定目标區域（6.5mm X 6.5mm範圍内）。

2. 石蠟包埋組織提取的RNA，要求DV200≥ 50%。

DV200指的是RNA樣本中，長度大于200 nt的RNA分子數量占總分子數量的比例。DV200值越高，表明RNA分子的完整度越高。空間轉錄組的探針長度是25 25 nt，RNA分子越完整，跟探針結合的幾率就越高。如果RNA降解得過短，就會影響探針的捕獲效率。

檢測樣本DV200時，一般切取5-10片切片進行RNA抽提，再使用片段分析儀進行RNA分子長度檢測。

上圖顯示的樣本來自DV200<50%（A）和DV200>50%（B和C）

3. 組織黏附試驗:确保切片與試片黏附良好。

通過切片脫蠟染色再複水，顯微成像觀察脫片情況，保證正式實驗樣本切片能牢固的粘附在玻片上，防止後續實驗過程中加各種試劑或洗滌浸水導緻切片脫落。

上圖從左到右：無脫片、小範圍脫片、大範圍脫片、完全脫片

雲準醫藥科技（上海）有限公司（以下簡稱：雲準）英文名：AccuraMed，用精準和醫藥相結合。雲準成立于2016年，是一家專注于組織生物學标記物檢測分析、腫瘤創新藥物靶點發現及臨床病理免疫診療檢測方案開發的高科技公司。針對當前熱點的腫瘤免疫相關研究緻力于為客戶提供先進的腫瘤組織免疫微環境分析解決方案。目前我們公司代理Akoya的産品（PhenoCycler平台和PhenoImager平台），并基于此可以提供腫瘤免疫微環境檢測相關技術服務。此外雲準科技還可以為您提供單細胞 空間多組學技術服務，全方位解析生命的奧秘。雲準科技擁有顯微切割平台及Thunder活細胞成像平台，為您提供專業的顯微切割和Thunder活細胞成像服務。此外我們公司還有配備了3i顯微鏡成像系統，可以為您提供Marianas LightSheet 成像技術服務和Cleared Tissue LightSheet組織透明化成像服務。此外我們還引進了Agena核酸質譜進行基因分型的檢測服務。未來，雲準将以創新為驅動力，繼續對産品進行深度整合與開發，推動腫瘤免疫、創新免疫療法和病理診斷技術的突破性發展，必将為腫瘤的診斷和治療帶來革命性變化。