2019-07-11 作者：EWG1990儀器學習網

高效液相色譜理論

1、塔闆理論

①塔闆理論介紹：塔闆理論是 Martin 和 Synger 首先提出的色譜熱力學平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱内的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔闆間隔内的分配平衡過程。這個理論假設：色譜柱内存在許多塔闆，組分在塔闆間隔（即塔闆高度）内完全服從分配定律，并很快達到分配平衡；樣品加在第0号塔闆上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略；流動相在色譜柱内間歇式流動，每次進入一個塔闆體積；在所有塔闆上分配系數相等，與組分的量無關；雖然以上假設與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動态過程，很難達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔闆理論導出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能夠評價色譜柱的柱效。

理論塔闆高度就是指被測組分在兩相間達到分配平衡時的塔闆高度間隔，以 n 表示。這個理論還假設：在色譜柱中，各段塔闆高度間隔都是一樣的，如果色譜柱的高度為 L，則一根色譜柱的塔闆數目應為：n=L/H。式中的 n 被稱為理論塔闆數，塔闆數的多少是分餾塔分離效率高低的标志，對色譜柱而言，塔闆數越多，柱效越高。

②色譜流出曲線方程及定量參數（峰高 h 和峰面積 A）：根據塔闆理論，流出曲線可用下述正态分布方程來描述：C=e。

由色譜流出曲線方程可知：當 t=tR 時，濃度 C 有極大值，Cmax就是色譜峰的峰高。當實驗條件一定時（即σ一定），峰高 h 與組分的量 C0（進樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析；當進樣量一定時，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此，提高柱效可以提高 HPLC 分析的靈敏度。

由流出曲線方程對 V（0～∞）求積分，即得出色譜峰面積 A=2.507σCmax=C0。可見 A 相當于組分進樣量 C0，因此是常用的定量參數。把 Cmax=h 和 Wh/2=2.355σ代入上式，即得 A=1.064Wh/2h，此為正常峰的峰面積計算公式。

2、速率理論（又稱随機模型理論）

①液相色譜速率方程：1956年，荷蘭學者 Van Deemter 等人吸收了塔闆理論的概念，并把影響塔闆高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論——速率理論。它把色譜過程看作一個動态非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬（即柱效）的影響。後來 Giddings 和 Snyder 等人在 Van Deemter 方程（H=A B/u Cu，後稱氣相色譜速率方程）的基礎上，根據液體與氣體的性質差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）。

②影響柱效的因素

a.渦流擴散（eddy diffusion）。由于色譜柱内填充劑的幾何結構不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴散項A=2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC 常用填料的粒度一般為3～10μm，最好為3～5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規則均勻，λ越小。總的說來，應采用細而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細管無填料，A=0。

b.分子擴散（molecular diffusion），又稱縱向擴散。由于進樣後溶質分子在柱内存在濃度梯度，導緻軸向擴散而引起的峰展寬。分子擴散項B/u=2γDm/u。u為流動相線速率，分子在柱内的滞留時間越長（u小），展寬越嚴重。在低流速時，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動相中的擴散系數，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4～10-5，因此在 HPLC 中，隻要流速不太低的話，這一項可以忽略不計。γ是考慮到填料的存在使溶質分子不能自由地軸向擴散而引入的柱參數，用以對Dm進行校正。γ一般在0.6～0.7，毛細管柱的γ=1。

c.傳質阻抗（mass transfer resistance）。由于溶質分子在流動相、靜态流動相和固定相中的傳質過程而導緻的峰展寬。溶質分子在流動相和固定相中的擴散、分配、轉移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質速率是有限的，這一時間上的滞後使色譜柱總是在非平衡狀态下工作，從而産生峰展寬。

從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：進樣時間要短；填料粒度要小；改善傳質過程，過高的吸附作用力可導緻嚴重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附；适當的流速，以 H 對 u 作圖，則有一最佳線速率 uopt，在此線速率時，H最小。一般在液相色譜中，uopt 很小（0.03～0.1mm/s），在這樣的線速率下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s 的條件下操作，能有較小的檢測器死體積。

③柱外效應：速率理論研究的是柱内峰展寬因素，實際上在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應（色譜峰在柱外死空間裡的擴展效應）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和。

其他柱外效應主要由低劣的進樣技術、從進樣點到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應，首先，應盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的内腔體積應盡可能小。其次，希望将樣品直接進在柱頭的中心部位，但是由于進樣閥與柱間有接頭，柱外效應總是存在的。此外，要求進樣體積≤VR/2。

柱外效應的直觀标志是容量因子 k 小的組分（如k<2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于 HPLC 的特殊條件，當柱子本身效率越高（N 越大），柱尺寸越小時，柱外效應越突出。

3、色譜分離原理

根據分離機制不同，高效液相色譜可分為四大基礎類型：分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜和凝膠色譜。

①分配色譜法：分配色譜法是四種液相色譜法中應用最廣泛的一種。它類似于溶劑萃取，溶質分子在兩種不相混溶的液相即固定相和流動相之間按照它們的相對溶解度進行分配。一般将分配色譜法分為液-液色譜和鍵合相色譜兩類。液-液色譜的固定相是通過物理吸附的方法将液相固定相塗于載體表面。在液-液色譜中，為了盡量減少固定相的流失，選擇的流動相應與固定相的極性差别很大。

a.液-液色譜：按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法（NPC）和反相色譜法（RPC）。

正相色譜法：采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與氰基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正己烷、環己烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

反相色譜法：一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。适用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC 在現代液相色譜中的應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC 應用的80%左右。

随着柱填料的快速發展，反相色譜法的應用範圍逐漸擴大，現已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的 pH 值。但需要注意的是，一般的 C18 和 C8 使用的 pH 值通常為2～8，太高的 pH 值會使矽膠溶解，太低的 pH 值會使鍵合的烷基脫落；但也有新液相色譜柱可在 pH 1～14範圍操作。

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從下表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。

正相色譜法與反相色譜法比較表

項目正相色譜法反相色譜法固定相極性高~中中~低流動相極性低~中中~高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出

b.鍵合相色譜：通過化學反應将有機分子鍵合在載體或矽膠表面上形成固定相。目前，鍵合固定相一般采用矽膠為基體，利用矽膠表面的矽醇基與有機分子之間成鍵，即可得到各種性能的固定相。一般來說，鍵合的有機基團主要有兩類：疏水基團、極性基團。疏水基團有不同鍊長的烷烴（C8 和 C18）和苯基等。極性基團有丙氨基、氰乙基、二醇基、氨基等。與液-液色譜類似，鍵合相色譜也分為正相鍵合相色譜和反相鍵合相色譜。

在分配色譜中，對于固定相和流動相的選擇，必須綜合考慮溶質、固定相和流動相三者之間分子的相互作用力才能獲得好的分離。三者之間的相互作用力可用相對極性來定性地說明。分配色譜主要用于分子量低于5000，特别是分子量在1000以下的非極性小分子物質的分析和純化，也可用于蛋白質等生物大分子的分析和純化，但在分離過程中容易使生物大分子變性失活。

②吸附色譜法：吸附色譜又稱液-固色譜，固定相為固體吸附劑。這些固體吸附劑一般是一些多孔的固體顆粒物質，在它的表面上通常存在吸附點。因此，吸附色譜是根據物質在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。分離過程是吸附—解吸附的平衡過程。常用的吸附劑有氧化鋁、矽膠、聚酰胺等有吸附活性的物質，其中矽膠的應用最為普遍。适用于分離分子量為200～1000的組分，大多數用于非離子型化合物，離子型化合物易産生拖尾。液-固色譜常用于分離那些溶解在非極性溶劑中、具有中等分子量且為非離子型的試樣。此外，液-固色譜特别适于分離幾何異構體。

③離子交換色譜法：離子交換色譜是利用被分離物質在離子交換樹脂上的離子交換勢不同而使組分分離。一般常用的離子交換劑的基質有三大類：合成樹脂、纖維素和矽膠。作為離子交換劑的有陰離子交換劑和陽離子交換劑，它們的功能基團有—SO3H、—COOH、—NH2及—N R3。流動相一般為水或含有有機溶劑的緩沖液。被分離組分在色譜柱上分離的原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團的作用強弱有關外，它還受流動相的 pH 值和離子強度的影響。pH 值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導緻樣品較快流出。

離子交換色譜适于分離離子化合物、有機酸和有機堿等能電離的化合物和能與離子基團相互作用的化合物。它不僅廣泛應用于有機物質，而且廣泛應用于生物物質的分離，如氨基酸、核酸、蛋白質、維生素等。

④凝膠色譜法：凝膠色譜又稱尺寸排斥色譜。與其他液相色譜方法不同，它是基于試樣分子的尺寸大小和形狀不同來實現分離的。凝膠的空穴大小與被分離的試樣分子的大小相當。太大的分子由于不能進入空穴，被排除在空穴之外，随流動相先流出；小分子則進入空穴，與大分子所走的路徑不同，最後流出來。中等分子處于兩者之間。常用的填料有瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺。流動相可根據載體和試樣的性質，選用水或有機溶劑。凝膠色譜的分辨力高，不會引起變性，可用于分離分子量高（>2000）的化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等，但其不适于分離分子量相似的試樣。

從應用的角度講，以上四種基本類型的色譜法實際上是相互補充的。對于分子量大于10000的物質的分離主要适合選用凝膠色譜；低分子量的離子化合物的分離較适合選用離子交換色譜；對于極性小的非離子化合物最适用分配色譜；而對于要分離非極性物質、結構異構，以及從脂肪醇中分離脂肪族化合物等最好要選用吸附色譜。

綜上所述，高效液相色譜作為物質分離的重要工具，在各個方面都取得了很大的發展，出現了許多新型色譜。在分配機制方面，親和色譜則是根據另一類分配機制而進行分離的新型色譜，它是利用生物大分子與其相應互補體間特異識别能力進行多次差别分離的一種色譜，具有選擇性高、操作條件溫和的特點。在流動相方面，超臨界流體色譜以超臨界流體為流動相。混合物在超臨界流體色譜上的分離機理與氣相色譜及液相色譜一樣，即基于各化合物在兩相間的分配系數不同而得到分離。超臨界流體色譜融合了氣相色譜和液相色譜的一些特征，具有比氣相色譜和液相色譜更廣泛的應用範圍。在固定相方面，高分子手性固定相實現了手性藥物的分離。同時，近年來，為了使物質的檢測更加準确方便，出現了各種 HPLC 串聯技術。以 HPLC-MS 為例，它結合了 HPLC 對樣品高分離能力和 MS（質譜法）能提供分子量與結構信息的優點，在藥物、食品、環境分析等領域發揮作用，提供可靠的數據。

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