作者：諾衡分析

導語

本篇主要對磺酸酯類雜質進行詳述。

概述

在制藥行業中，磺酸或磺酰鹵類試劑常被用作烷基化試劑和催化劑，還常應用于藥物化學合成的純化或成鹽步驟。合成反應或重結晶步驟中任何殘留醇的存在都可能導緻形成磺酸酯。臨床研究發現磺酸酯能夠直接與生物大分子(DNAs、RNAs及蛋白質)發生烷基化反應，可能會導緻DNA 的突變。甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯及甲磺酸異丙酯已被證明具有基因毒性，而其他具有磺酸基的物質可能存在潛在基因毒性，對人類健康造成威脅。因此，利用各種分析技術手段研究檢測磺酸酯的限度是非常必要的，對于此類基因毒性雜質的測定，除了需要克服靈敏度、選擇性以及樣品基質幹擾等挑戰外，磺酸酯的高反應活性也為分析方法的開發帶來了難度。

磺酸酯根據取代基不同可分為烷基磺酸酯和芳基磺酸酯。烷基磺酸酯，如甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸異丙酯(IMS)、甲磺酸正丁酯(NBMS)等；芳基磺酸酯，如苯磺酸甲酯(MBS)、苯磺酸乙酯(EBS)、對甲苯磺酸酯(MP-TS)等。這些磺酸酯是由甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸與甲醇、乙醇或其它低級醇結合而形成的。藥物活性成分如以烷基磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及羟乙基磺酸鹽形式存在或藥物合成過程中使用到了磺酸類試劑，磺酸酯就會被視為潛在的基因毒性雜質而存在。

按照美國FDA和EMEA指南的要求，必須對原料藥或藥品中任何可能存在、未在早期合成步驟中清除的所有基因毒性雜質進行監測。對于基因毒性雜質來說，限度則需控制到ppm級别，所以基因毒性雜質的标準比普通雜質嚴格了近百倍乃至千倍。

常用的檢測方法

直接進樣法

烷基磺酸酯類化合物沸點較低，适合用GC法測定。目前歐洲藥典( EP) 已經給出了通用的基因毒性雜質檢測方法，利用GC 方法分别針對活性成分中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯及甲磺酸酰氯進行檢測。但常規的GC法靈敏度較低，較難達到痕量基因毒性雜質檢測限度的要求，目前常采用GC-MS法來測定磺酸酯類雜質。芳基磺酸酯類化合物的沸點較高，不适合采用GC法測定，故常采用高效液相色譜法進行測定。為進一步提高檢測的靈敏度，現在多采用LC-MS、和LC-MS/MS方法進行測定。

衍生化法

提為進一步提高檢測靈敏度，提高樣品的穩定性，避免發生降解反應，可以對樣品進行适當衍生化處理後，再采用GC-MS、LC-MS等方法進行分析，便于檢測。歐洲藥典8.0中使用碘化鈉為衍生化試劑，采用HS-GC-MS法來測定甲磺酸倍他司汀中的甲磺酸甲酯( MMS) 、甲磺酸乙酯( EMS) 及甲磺酸異丙酯( IMS)。

提供以下兩個案列可供借鑒

苯磺酸氨氯地平

苯磺酸氨氯地平(結構式如圖1)，是氨氯地平的苯磺酸鹽，是一種長效鈣通道阻滞劑，可用于療高血壓。氨氯地平在合成過程中使用到了溶劑正丙醇或異丙醇，而在與苯磺酸成鹽時，用甲醇作為氨氯地平與苯磺酸的反應溶劑，乙醇作為最終重結晶的溶劑。因此在整個合成過程就有可能中形成具有潛在基因毒性的苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸異丙酯(如圖2)。因此，必須監測該類藥物中是否存在這些化合物。該藥物一般通過口服攝入，最大每日劑量為10 mg，對應的四種基因毒性雜質的總TTC水平為150 ppm。

因此，利用HPLC-UV的方法同時測定四種雜質，根據ICH指南要求，對方法進行了檢測限(LOD)、定量限(LOQ)、線性、精密度、準确性等相關驗證，該方法靈敏度高、操作便捷且無任何幹擾，在該方法下四種基因毒雜質的檢測限分别為7ppm、11ppm、12ppm和9ppm，均能達到檢測的需求。

圖1. 苯磺酸氨氯地平結構式

圖2. 四種苯磺酸酯的來源

甲磺酸伊馬替尼

甲磺酸伊馬替尼(結構式如圖3)是酪氨酸激酶抑制劑，由FDA批準上市，用于治療胃腸道基質瘤和慢性粒細胞性白血病加速期、急變期和慢性期幹擾素耐藥的患者。因甲磺酸伊馬替尼在合成過程中，需要将伊馬替尼和甲磺酸分别溶于甲醇後進行反應，反應結束後，除去甲醇，再加入乙醇回流溶解，最後放置冰浴中析晶，得到成品。所以，在成鹽及純化過程中有可能會生成甲磺酸甲酯(MMS)和甲磺酸乙酯(EMS)(如圖4)。MMS和EMS已經被證實具有遺傳毒性和緻癌性，盡管甲磺酸伊馬替尼可以抑制癌細胞的生長，但MMS和EMS的基因毒性可能會增加用藥的風險。依據EMA和FDA相應的指導原則，有必要對苯磺酸伊馬替尼中的MMS和EMS進行定量分析。

因此，利用GC-MS的方法進行檢測，該方法在現有的方法上進行了優化，省去了衍生化複雜的操作步驟，直接進樣檢測。該方法選擇正己烷為溶劑，解決了樣品溶解度問題且無基質幹擾，在該方法下MMS和EMS的檢測限均為0.3μg/mL，兩種雜質在1~15 μg/mL的濃度範圍内均成良好的線性關系，相關系數R2>0.999，收率在98.1%~99.6%之間，符合檢測的要求。

圖3. 甲磺酸伊馬替尼結構式

圖4. 兩種苯磺酸酯的來源

總結

磺酸酯類化合物作為潛在基因毒性雜質，從很多方面都可能引入，可以從以下幾個方面考慮來進行管控：

a.對起始物料(如甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、羟乙基磺酸)中是否含有烷基磺酸酯或芳基磺酸酯雜質進行檢查

b.對藥物活性成分的生産過程進行監測，檢查在甲磺酸、羟乙基磺酸、苯磺酸或對甲苯磺酸及相應的酰氯存在的情況下是否使用了低級醇

c.确認生産過程中接觸到磺酸類試劑的設備清洗程序中是否有涉及到低級醇的使用

d. 在制劑過程中如制粒、壓片時是否使用了低級醇等試劑。

因此，雜質的研究必須要全面，這就要求我們對整個可能會産生的環節進行詳細的控制，加強要求和監管，從而能夠規避很多不可預見的風險。

工藝控制是避免産生基因毒雜質的根本性解決方法，而方法檢測則是一個概率性抽檢的事情。将兩者完美相結合，就能達到我們最終的要求。另外值得注意的是，同樣的藥物因合成工藝不同，則存在的基因毒雜質也不同，因此需要建立适宜的分析方法和質量标準來證實藥物活性成分中的烷基磺酸酯或芳基磺酸酯雜質是否處于毒理學阈值(TTC，Threshold of Toxicological Concern)以下。