原創 納曉瑩等 南京林業大學學報

論文推薦

4種基因表達量和光合參數差異對白桦無性系幼苗生長的影響

納曉瑩，劉 剛，劉桂豐，王秀偉*

東北林業大學森林生态系統可持續經營教育部重點實驗室，東北林業大學林學院。

白桦(Betula platyphylla Suk.)廣泛分布于我國東北以及華北等地區,具有速生、耐嚴寒、适應性強等特征,是我國人工林的主要樹種之一。近年來,提高白桦的光合能力,進而提升白桦人工林的造林質量,産生更大的社會、生态和經濟價值是研究熱點。植物的生物量和生物産量主要取決于光合作用,影響植物光合效率的因素很多,有研究表明,植物缺乏磷元素會使光合磷酸化過程中有機磷循環受阻從而降低光合速率;也有人認為，提高光合作用效率的關鍵之一是增強與光合作用相關的酶的催化效率。如,核酮糖-1 ,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)催化光合作用中暗反應的第一步,但是其催化效率卻很低,而植物為了彌補Rubisco較低的催化效率,會大量積累Rubisco于細胞内,使其含量占植物細胞内可溶性蛋白的20% ~50%,但這也大大降低了植物對氮素的利用效率。

由于酶在光合作用暗反應階段發揮了重要的作用,因此,筆者選取Rubisco、 Rubsico活化酶(RCA)和乙醇酸氧化酶(GO)3種酶作為研究對象。Rubisco負責對光合作用中CO₂的固定過程進行催化,此反應是光合作用中碳固定的關鍵步驟。RBCS多基因家族負責編碼Rubisco的小亞基, RBCS1A、RBCS3B是RBCS多基因家族兩個主要成員。RCA負責對葉片内的Rubisco進行活化, Rubisco隻有經過活化才能表現出其羧化/加氧活性,即Rubisco在植物體内的活性取決于RCA對它的活化作用。GO在植物光呼吸過程中負責将乙醇酸氧化成乙醛酸,雖然GO與碳固定的相關性可能不高,但是由于其參與催化光合作用的光呼吸過程,因此選擇GO作為對照基因,探索GO與光合速率的關系。

本期論文推薦的作者采用标準化實驗方法,測定6組不同1年生白桦無性系幼苗的苗高和地徑、4種特定基因(RBCS1A、RBCS3B、RCA、GO)相對表達量以及6種光合作用參數(淨光合速率、胞間CO₂濃度、瞬時水分利用效率、氣孔導度、羧化效率、蒸騰速率),比較無性系間生長量的差異,并分析兩個生長量參數(苗高、地徑)與基因表達量和光合參數間的相關性,以期找出對白桦幼苗生長有影響的相關因素，為我國白桦幼苗培育技術提供理論依據。

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作者簡介

通訊作者

王秀偉，男，1981年生，東北林業大學林學院教授，博士生導師，主要研究方向為樹木生理學和植物生态學研究生。

第一作者

納曉瑩，女，1990年生，東北林業大學林學院林木遺傳育種專業碩士研究生。

關鍵詞：白桦無性系；幼苗；生長量；基因表達量；光合參數

基金項目：國家自然科學基金項目(31670476) ;黑龍江省應用技術研究與開發計劃項目(GA20B401);中央高校基本科研業務費專項( 2572019BA15,2572019CP09)。

引文格式：納曉瑩,劉剛,劉桂豐,等.4種基因表達量和光合參數差異對白桦無性系幼苗生長的影響[J].南京林業大學學報(自然科學版),2022,46(2):88-94.NA X Y ,LIU G,LIU G F , et al. Differences in the expression of four genes and photosynthetic parameters in seedlings of different birch clones and their effects on growth[J]. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition),2022,46(2):88-94.DOI:10.12302/j.issn.1000-2006.202103037.

1目的

分析1年生白桦(Betula platyphylla)無性系幼苗RBCS1A、RBCS3B、GO、RCA基因表達量和光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、瞬時水分利用效率、胞間CO₂濃度、羧化效率與苗高、地徑的相關性,探索基因表達量和光合參數對白桦無性系幼苗生長初期的影響。

2方法

在白桦雙列雜交子代林中選擇6株成熟的樹木進行組織培養,随後将其擴繁為6個無性系,對1年生白桦無性系幼苗的生長量與光合參數和4個與光合作用相關的基因表達量進行測定分析。

2.1 試驗材料

植物材料。從白桦雙列雜交子代林中選擇6株長勢良好的樹木進行組織培養獲得的無性系幼苗。2014年5月1日,将幼苗移至室外設置的溫室大棚中進行培養,2015年5月收獲1年生白桦無性系幼苗,分别命名為3号、15号、21号、33号、52号、56号,在自然環境中适應1個月後測定相關參數。

實驗試劑及引物合成。通用植物總RNA提取試劑盒(離心柱型, BioTeke , RP3002 ), RNASE RE-MOVER I(華越洋,0416),反轉錄試劑盒(TOYo-BO, FSQ-301 ) ,SYBR Green ( Realtime PCR MasterMix-Plus-TOYOBO , QPK-212)。實驗中所用引物由金唯智生物工程股份有限公司合成。

實驗儀器與軟件。Eppendorf常溫離心機(5424,德國)，Eppendorf低溫離心機(5407,德國), IMPLEN超微量分光光度計(P330,德國),熒光定量PCR儀(ABI 7500,美國),便攜式光合測量系統(Li-6400,LI-COR ,Nebraska,美國)等;7500Software v2.0.6 ( Applied Biosystems ,美國)， Office2010( Microsoft,美國),BD 8.10 軟件(Premier ,加拿大),R 3.2.3等。

▲圖中為測定白桦無性系幼苗的苗高

2.2 實驗方法

1)光合指标的測定。于2015年6月9日上午9:00—10:0測定葉片的光合參數。每個白桦無性系選取3株生長正常的幼苗,每株選擇2片完全伸展、長勢良好的健康成熟葉片進行測量,重複3次。測定時人工光照的光合有效輻射為1 000 μmol/ (㎡.s)。測定指标分别為淨光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO₂濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr),同時計算瞬時水分利用效率(EWUE=Pn/Tr)和羧化效率(ECUE=Pn/Ci)。

2)總RNA 的提取和cDNA的合成。用通用植物總RNA提取試劑盒提取6株白桦無性系幼苗葉片的總 RNA;使用超微量分光光度計檢測提取RNA的質量,确定 RNA的濃度;通過反轉錄試劑盒将總RNA反轉錄合成第一鍊cDNA ,并在﹣20 ℃條件下保存反應液。3)實時熒光定量PCR(聚合酶鍊式反應)。根據白桦基因組和轉錄組數據庫中的數據設計目的基因定量引物和内參,為了确保引物的特異性,利用BLAST程序對引物進行比對,詳細的引物信息見表1。

▼表 1 實時熒光定量PCR引物信息

分别以6株白桦無性系幼苗的葉片cDNA 為模版,每個無性系進行3次生物學重複,每個模版進行4次技術重複,實時熒光定量PCR反應采用SYBR Green法(反應體系包括超純水4.4 μL、熒光染料SYBR10.0 μL、緩沖溶液2.0 μL、引物-F0.8 μL、引物-R0.8 μL、模闆DNA2.0 μL) ,PCR具體反應程序見表2。熒光信号校正使用參比染料(ROX);熒光數據類型選擇基線校正的标準化熒光值;采用Amplification-based threshold 對阈值進行計算;采用“Treat Collectively”算法對技術重複的數值進行合并;采用參比染料标準化的熒光值的一階導數對溶解曲線進行分析;采用ΔΔCT法計算基因的相對表達量:

式中:ΔCTMZ表示目标株系目的基因與内參基因阈值循環數差值,CTM表示目的基因阈值循環數,CTN表示内參基因阈值循環數,CTGE表示目的基因相對表達量。熒光阈值設定為0.07(由擴增曲線結果得出),使用得到的樣本CT對各相關參數進行計算。公共内參CT值為BpSAND和BpUBQ兩個内參CT值的幾何平均數。使用3号幼苗葉片的各基因表達量作為參考,計算各無性系幼苗葉片RBCS1A、RBCS3B、GO和RCA基因的相對表達量。

2.3 數據分析

使用R3.2.3進行數據分析和繪圖。經檢驗，研究中所有變量值均符合正态分布。運用單因素方差分析和多重比較分析不同無性系間基因相對表達量和光合參數間的差異,采用Pearson相關性分析評價參數之間的二元相關性。

▼表 2 實時熒光定量PCR反應體系

3結果

6種不同基因型白桦無性系幼苗的生長量、光合參數及基因表達量間差異顯著(P<0.05);光合參數間表現出了密切的相關性,其中淨光合速率與瞬時水分利用效率、蒸騰速率、氣孔導度、羧化效率顯著正相關(P<0.05)。RBCS1A的表達量與RBCS3B顯著正相關,RBCS1A的表達量與RCA顯著正相關，GO基因的表達量與RCA顯著負相關(P<0.05)。基因表達量與植物的蒸騰速率、淨光合速率、瞬時水分利用效率及氣孔導度間均表現出了顯著相關性(P<0.05),但基因表達量和光合參數與白桦幼苗的苗高、地徑相關性未達到顯著水平(P>0.05)。

3.1 不同白桦無性系幼苗苗高、地徑的差異

從不同白桦無性系生長情況(圖1)可知,無性系間苗高(H)和地徑(D)的差異顯著(P<0.05) ,整體上,地徑随着苗高的增加而增加;6種白桦無性系幼苗的苗高為85.38~123.39 cm,地徑為5.73~7.56 mm;苗高從高到低排序為15号、33号、52号、3号、21号和56号,表現最優的是15号(123.39 cm),表現最差的是56号(85.38 cm);地徑最大的是無性系3号(7.56 mm),最小的是無性系56号(5.73 mm)。

▲圖 1 不同白桦無性系幼苗苗高、地徑的差異比較

注：圖中不同小寫字母表示苗高或地徑Duncan檢驗差異顯著(P<0.05)。下同。

3.2 不同白桦無性系幼苗光合參數的差異

白桦無性系幼苗光合參數的差異見圖2。由圖2可以看出:無性系間Ci差異顯著(P<0.05) ,Ci的變化範圍為261.06~284.07 μmol/mol ,最高的是無性系21号,最低的是無性系33号;無性系間EWUE和ECUE表現出了顯著的差異(P<0.05 )，EWUE最高的為無性系33号、最低的為21号,ECUE最高的為無性系33号和56号,顯著高于其他無性系，最低的為無性系3号;不同無性系間Gs、Tr、Pn均存在顯著差異(P<0.05) ,Gs較高的為無性系21号[0.26 μmol/(㎡·s)]和無性系56 号[0.28 μmol/ (㎡·s)]、最低的為無性系3号[0.15 μmol/(㎡·s)];T,最高的是無性系21号[7.09 mmol/(㎡.s)],顯著高于其他的無性系,最低的是無性系3号[4.44 mmol/ (㎡·s)],顯著低于無性系21号、56号以及15号;Pn較高的為無性系33号和56号[分别為14.37和14.97 μmol/ (㎡·s)],顯著高于其他的無性系,最低的為無性系3号的 9.83 μmol/ (㎡·s) ,顯著低于其他無性系。

▲圖 2 不同白桦無性系幼苗淨光合速率、氣孔導度、胞間CO₂濃度、蒸騰速率、瞬時水分利用效率、羧化效率的差異

3.3 白桦無性系幼苗RBCS1A、RBCS3B、GO與RCA基因相對表達量的差異

不同白桦無性系幼苗RBCS1A、RBCS3B、GO與RCA基因相對表達量間存在顯著差異(P<0.05)(圖3)。所有的無性系中4種基因相對表達量以RCA的最高(除了56号),GO基因的最低(除了3号),且在無性系21号中RCA相對表達量最高、GO的相對表達量最低。就不同基因來看,RBCS1A的相對表達量在無性系21号、33号、56号中較高，15号中最低;RBCS3B的相對表達量在無性系33号、56号中較高,15号中最低;GO的相對表達量在無性系3号、33号中較高,且顯著高于其他無性系,在21号中最低;RCA的相對表達量在無性系21号中最高,且顯著高于其他無性系,在15号中最低。同時,基因RBCS1A和RBCS3B的相對表達量在不同白桦無性系幼苗中顯示出了相同的變化趨勢。而4種基因的總表達量中,33号的最高,15号的最低。

▲圖 3 不同白桦無性系幼苗RBCS1A,RBCS3B,GO與RCA基因相對表達量的差異

3.4 白桦無性系幼苗基因相對表達量、光合參數與生長量之間的相關性分析

RBCS1A基因相對表達量與RCA基因相對表達量(R=0.920) 、RBCS3B基因相對表達量與RCA基因相對表達量(R=0.629)顯著正相關(圖4); GO基因相對表達量與RCA基因相對表達量(R=0.326)顯著負相關;其他基因間沒有表現出顯著相關性。白桦無性系幼苗6個光合參數也表現出了顯著的相關性,其中,Pn與Gs(R=0.736)、Tr(R=0.499)及ECUE(R=0.937)顯著正相關;Gs與Ci(R=0.727)、Tr(R=0.818 )、ECUE(R=0.472)顯著正相關;Ci與Tr顯著正相關,與EWUE顯著負相關;Tr與EWUE顯著負相關,與ECUE顯著正相關;EWUE與ECUE顯著正相關。基因RBCS1A、RBCS3B的相對表達量與Pn、Tr顯著正相關。植物的生長量參數(苗高、地徑)與基因相對表達量及光合參數的相關性未達到顯著水平(P>0.05)。

▲圖 4 基因相對表達量、光合參數與苗高、地徑之間Pearson相關性分析

注：圖中實線表示相關參數間顯著正相關,虛線表示相關參數顯著負相關;粗線表示顯著性水平P<0.01 ,細線表示顯著性水平P<0.05。

4結論

1年生白桦不同無性系幼苗4種基因的表達量和6種光合參數間差異顯著,并且表現出了密切的相關性,但與苗高、地徑相關性不顯著。說明在白桦幼苗生長的初期,4種基因的表達量和6種光合參數并不能夠顯著地影響白桦無性系幼苗的生長。

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