實驗原理

堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，堿變性抽提質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與複性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鍊不會完全分離，當以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調節其pH值至中性時，變性的質粒DNA又恢複原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能複性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質－SDS複合物等一起沉澱下來而被除去。

（簡明原理：堿裂解法是基于DNA的變性與複性差異而達到分離目的的。堿性使質粒DNA變性，再将pH值調至中性使其複性，複性的為質粒DNA，而染色體DNA不會複性，纏結成網狀物質，通過離心除去。）

細菌質粒是一類雙鍊、閉環的DNA，大小範圍從1kb至200kb以上不等。各種質粒都是存在于細胞質中、獨立于細胞染色體之外的自主複制的遺傳成份，通常情況下可持續穩定地處于染色體外的遊離狀态，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，随着染色體的複制而複制，并通過細胞分裂傳遞到後代。質粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質粒DNA。

主要試劑

1. LB液體培養基：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml蒸餾水中，用NaOH調pH至7.5，加水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌15分鐘。

2. 氨苄青黴素(Ampicillin，Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20℃保存備用。

3. 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。

配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高壓滅菌15min ，貯存于4℃。

4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。

配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。

5. 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。

配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存備用。

6. 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現的泡沫。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。

7. 無水乙醇；

8. 70%乙醇；

9. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。

配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。121℃高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。

1M Tris Cl（Tris(三羟甲基)氨基甲烷）：800ml H2O中溶解 121g Tris堿，用濃鹽酸調pH值，混勻後加水到1L；

0.5M EDTA（乙二胺四乙酸）：700ml H2O中溶解186.1g Na2EDTA.2H2O，用10M NaOH調 pH8.0(需約50ml)，補H2O到 1L。

10. RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5)，15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻後用1.5ml eppendorf管分裝成小份保存于-20℃。

主要設備

1. 微量移液器(20μl，200μl，1000μl)

2. 台式高速離心機

3. 恒溫振蕩搖床

4. 高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)

5. 渦旋振蕩器

6. 恒溫水浴鍋

7. 雙蒸水器

8. 冰箱

9. 1.5ml塑料離心管，離心管架

10. 槍頭及盒、衛生紙等。

實驗材料

含pUC19質粒的大腸杆菌

實驗步驟

1. 挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種于20ml LB（含Amp100ug/ml）液體培養基中，37℃、250rmp振蕩培養過夜（約12-14hr）。

2. 取1.5ml培養液倒入1.5ml eppendorf管中，12000rmp離心1-2min。棄上清，将離心管倒置于衛生紙上，使液體盡可能流盡。

3. 菌體沉澱重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩，使菌體分散混勻。)，室溫下放置5-10 min。

4. 加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和颠倒eppendorf管數次，以混勻内容物(千萬不要振蕩)，冰浴5 min，使細胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

5. 加入150μl預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，将管溫和颠倒數次混勻，見白色絮狀沉澱，可在冰上放置5min。 12000rmp離心10min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質粒DNA複性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶複合物，同時K 使SDS-蛋白複合物沉澱。

6. 上清液移入幹淨eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，12000rmp離心10min。（450μl的苯酚/氯仿/異戊醇。）

7. 小心移出上清于一新微量離心管中，加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置 2-5min，離心12000rmp×10min。

8. 棄上清，将管口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出，加入1ml 70％乙醇洗沉澱一次，12000rmp離心5 min。

9. 吸除上清液，将管倒置于衛生紙上使液體流盡，室溫幹燥。

10. 将沉澱溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，約4μl)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，儲于-20℃冰箱中。　

注意事項

1. 提取過程應盡量保持低溫。

2. 沉澱DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉澱完全。沉澱DNA也可用異丙醇(一般使用等體積)，且沉澱完全，速度快，但常把鹽沉澱下來，所以多數還是用乙醇。