前面已經介紹過蛋白樣品的制備及濃度測定,今天給大家介紹凝膠制備相關問題:
現在一些SDS-PAGE凝膠制備試劑盒操作簡便,得到了廣泛的應用。在實驗室中,我們常用的凝膠制備試劑盒有碧雲天和雅酶的。它們有可調控膠濃度試劑盒,也有固定濃度(eg:10%)凝膠試劑盒。其中碧雲天凝膠試劑盒分離膠和濃縮膠都是無色透明狀,雅酶的濃縮膠是彩色的,更便于看清加樣孔。
[左上]一般我們采用1mm厚的玻璃闆制膠,将玻闆固定好确認其密封,配制分離膠(也叫下層膠)約5ml,緩緩注入玻闆中,然後覆蓋一水層,室溫靜置15~20min待膠凝固;去除水層,配制濃縮膠(也叫上層膠)約2ml,最後插上1mm的梳子,室溫靜置20min左右。
在這裡值得注意的是,分離膠濃度的選擇與蛋白分子量大小、目的蛋白分子量等因素密切相關。同一條件下,膠濃度越高,所需電泳時間越長。蛋白分子量小的蛋白,通常膠濃度選大一些,反之亦然。如果實驗之前無法準确判斷膠濃度如何選擇,可以先用10%或12%的膠先做一次預實驗,後續再根據實際情況優化實驗條件。
濃縮膠一般是5%的濃度,不做其他濃度的調試。
膠注入玻闆時,應避免産生氣泡。在靜置待膠凝固時,可根據實驗室實際情況适當延長靜置時間,若凝膠時間短,可能會導緻電泳時出問題,進而影響實驗結果。
膠凝固好後,可拔出梳子,盡快将玻闆安裝于電泳裝置上,并在其電泳槽凹内加滿1x電泳緩沖液,以形成閉合回路保證電泳。(也可以先安裝固定玻闆,倒滿電泳緩沖液後再拔梳子)如若先拔梳子再加電泳緩沖液,可以使堵塞的膠孔有沖開的可能。
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