經典的轉膜方法是電轉移，因為電轉移需要配套垂直電泳槽來進行。如何做這個“海綿—幾層濾紙—膠—膜—幾層濾紙—海綿”的“三文治夾心”，在分子克隆上已經有詳細的介紹，相信大家都很容易找到。

中洪轉膜操作實拍圖

一些細節：

全程手套操作

一則避免手印污染影響結果；

二則保護自己(未交聯的丙烯酰胺、甲醛等等雖不立即緻命但都會慢慢毒害你的身體，可不要這樣白白為科學獻身哈)

如果WB前沒有可參考的資料——比如不知道是否有表達，比如抗體少還要摸條件(稀釋度)，可以用剪膜剩下的邊角料來先做幾組點雜交摸條件，省點時間省點試劑；

去掉積層膠後，預染的marker可用以識别膠上下方向和膜的正反面(預染Marker如果照着說明書用量，有可能在電泳時看不到條帶，但轉膜時有濃縮效應而且背景白就可以看到了。如果要電泳能看到就要參考電泳的那個用量，或者多加1—2倍的量);如果目标蛋白小，指示劑也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示劑已經跑出去了，就要留意分清膠上下方向，切個小角是常用的方法。

膜上要做好标記，識别正反面和上下。剪一個小小角最方便。膜和濾紙一起裁最好(不過濾紙上下疊多了膜不好剪，硝纖膜容易裂，用利刀 尺子 墊厚報紙劃比較容易)盡量和膠一樣大小，膠用純水沖洗一下後用電泳緩沖液平衡過再量。我自己通常剪的時候會故意長寬各比膠少1mm，保證膜和膠不會碰到對方背後的濾紙就好。

“三明治”做好以後，接下來的事情就簡單多了。把“三明治”鎖朝上插入E槽，方向是“黑對黑”、“白對紅”，荟荟解釋一下什麼叫“黑對黑”、“白對紅”：上面我們說了蛋白要從D夾的“黑”面轉向“白”面，所以D夾的“黑”面要對着電場的負極，“白”面對着正極。E槽内面如圖所示的方向分别有一排導電鉑金絲，E槽“黑”面的鉑金絲連着電源的負極，而“紅”面的鉑金絲連的是正極。所以“三明治”放入E槽的方向一定要将D夾的“黑”面對着E槽的“黑”面，D夾的“白”面對着E槽的“紅”面，以防蛋白轉反方向。E槽裡面可以放下兩塊“三明治”，所以可以同時轉兩塊膜。放好“三明治”，把E槽裝進電泳槽，任意裝，沒方向區别。按說後面倒上緩沖液、接上電源就可以開始轉了，但是！轉膜過程中由于産熱較多，我們必須給系統降降溫（這也是為什麼緩沖液要預冷的原因），所以小夥伴們習慣上把電泳槽埋到冰裡。荟荟一般是找個臉盆，或者一個冰盒（冰盒的效果好一點且省冰，不用太大，比電泳槽大一兩圈就行），先在底層鋪一層冰，然後放上電泳槽，接着把冰盒與電泳槽之間填滿冰塊兒，然後把緩沖液倒進電泳槽，但是先别全倒，因為我們還有一個降溫神器沒用上呢，那就是第一張圖裡的F白色盒。E槽放進電泳槽以後有一邊會留點空，這個空就是用來裝F盒的，但是F盒用之前得先放上一個小冰袋冷凍起來，這才能降溫。好了，把預先準備的F盒也放進電泳槽，把緩沖液倒滿電泳槽，然後把電泳槽的蓋子蓋上（注意對準蓋子和E槽電極的顔色），最後用冰把整個電泳槽全封住（露個蓋子也行，沒那麼誇張的），接通電源調節電流，注意是電流！電流！不是電壓！調節時間，開始轉膜。

跟電泳一樣，等待轉膜的過程童鞋們可以該幹嘛幹嘛，而且因為是定時的，所以童鞋們到點收貨就行，不用一直盯着，盯也盯不着，全被蓋住了。不過呢，時不時還是要看一眼，萬一系統出現錯誤呢。荟荟就遇到過一次系統錯誤，當然荟荟當時同時轉了四張膜，用了兩套轉膜系統，嘻嘻，一般是不會出錯的。轉膜完成以後系統會有提示，童鞋們斷開電、刨開冰，把“三明治”掏出來解鎖，然後打開D夾把膜取出來就行了。這時候膠變成透明的，而膜上多了一排marker。如果童鞋們不放心蛋白有沒有轉上去，可以有兩種辦法檢驗：一是把轉完的膠做個考馬斯亮藍染色，看還有沒有蛋白在膠上；二是把轉完的膜做個麗春紅染色，看膜上有沒有蛋白。但是一般是不會有問題的。轉完膜，荟荟喜歡把膜修剪一下，因為準備膜的時候大家都會剪得比較大，怕不夠，但是越大的膜孵育抗體的時候用的抗體的量就越多，所以荟荟喜歡盡量把膜修小一點。這時候NC膜就又體現了優勢，轉完的NC膜由于長時間被擠壓會形成跟膠一樣的形狀，所以荟荟隻要沿着形狀的邊緣修剪就好了，但是PVDF膜由于韌性好，擠不出來形狀，所以修的時候就比較桑腦筋，這也是荟荟喜歡NC膜的原因，之二。這裡荟荟要提醒童鞋們，如果童鞋們也選擇修剪膜的話，剪完以後一定記得把原先在膜上剪的标記再做一遍。到這裡為止，轉膜就說完啦。

轉膜後的封閉注意：

轉膜後，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。

Western的靈敏度某種程度上受限于封閉做的好不好。脫脂奶是最常用的經濟配方(實驗太晚了還可以補充一下營養，哈哈)，用這種封閉劑由于裡面可能有痕量的生物素和堿性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素—親和素的檢測方法(如果用了生物素标記的Marker而且結果背景較高，分析結果也有可能是受此影響)，脫脂奶也不适合堿性磷酸酶檢測(AP)方法。如果采用堿性磷酸酶檢測系統，封閉劑最好用6%酪蛋白 1%聚乙烯吡咯烷酮 10mmol/L EDTA磷酸緩沖鹽加熱65度1小時确保堿性磷酸酶失活(可以加0.05%疊氮化鈉，新鮮最好)。經濟的脫脂奶配方和AP兼容得不太好，再加上HRP的底物選擇範圍也更寬，現在HRP是越來越普遍的選擇。但是疊氮鈉(NaN3)對辣根過氮化物酶(HRP)有滅活作用，如果用HRP檢測系統則封閉液不要加疊氮化鈉為好。切記。封閉時間和封閉劑的量都要足夠。封閉不完全，後面就全白忙活了。

如果選用AP作為顯色方法，封閉時就要選擇Tris緩沖體系，不要用PBS，因為PBS幹擾AP。

注意事項：

1. 凝膠靠近負極，膜靠近正極，兩邊的濾紙不要接觸到，防止短路；

2. 制作“三明治”過程中，戴手套并用鑷子夾住膜的邊緣，避免手上的蛋白或油脂降低轉膜效率；

3. 凝膠和膜以及濾紙之間不要有氣泡，會導緻轉膜不完全；

4. 整個“三明治”的制作過程都在轉膜液中進行；

5. 轉摸過程會有非常嚴重的放熱現象，因此最好在冰浴或冰室中進行。