在一些微生物實驗室或者需要無菌操作的場所，想了解滅菌的具體效果就需要生物指示物的幫助。通常滅菌指的是用物理或化學的方式将目标微生物全部殺滅，使之達到無菌保障水平，一般最常用的有化學試劑、射線、濕熱、幹熱以及過濾等除菌手段。針對不同的微生物采用的方法也不一樣。而想要驗證這些方法的效果，就需要一些具有滅菌耐受力的活微生物作為指示物來進行判斷。

今天我們要講的枯草芽孢杆菌黑色變種主要用于各類醫療機構及制藥工業領域的消毒效果驗證中，其原理是經過滅菌處置後含有枯草芽孢杆菌黑色變種的水樣在通過孔徑為0.45um的濾膜後，細菌和芽孢被截留在濾膜上，然後将濾膜置于酪氨酸瓊脂培養基上，36℃±1℃培養72h-96h，枯草芽孢杆菌黑色變種産生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，産生黑色的特征菌落。對特征菌落進行染色鏡檢後通過生化試驗做進一步鑒定，能利用甘油和甘露糖，可還原硝酸鹽和水解澱粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并确認為革蘭氏陽性芽孢杆菌的特征菌落為枯草芽孢杆菌黑色變種，鑒定結果為陽性。

1.酪氨酸瓊脂培養基。

2.營養瓊脂培養基。

3.澱粉培養基和碘液。

4.硝酸鹽還原培養基和相關試劑。

5.甘油複紅肉湯培養基。

6.甘露糖生化培養基。

7.甘露醇生化培養基。

8.苦杏仁苷生化培養基。

9.革蘭氏染色液。

10.芽孢染色液。

11.陰性對照菌：如地衣芽孢杆菌。

12.陽性對照菌：枯草芽孢杆菌黑色變種。

13.枯草芽孢杆菌黑色變種芽孢懸液

按照《消毒技術規範》的規定制備，也可購買濃度範圍在106CFU/ml-109CFU/ml之間的市售枯草芽孢杆菌黑色變種芽孢懸液。

14.無菌濾膜：直徑50mm，孔徑0.45μm的醋酸纖維濾膜。

按無菌操作要求包紮，經121℃高壓蒸汽滅菌20min，晾幹備用；或将濾膜放入燒杯中，加入實驗用水，煮沸滅菌3次，15min/次，前2次煮沸後需換水洗滌2-3次。也可采用市售的無菌濾膜。

15.石蠟質封口膜。

16.無菌水：取适量實驗級純水，經121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.樣品瓶：螺口帶蓋或磨口具塞的250ml、500ml廣口玻璃瓶。

2.恒溫培養箱：36℃±1℃。

3.高壓蒸汽滅菌器：121℃，可調。

4.pH計：準确到0.1pH單位或更高精度。也可使用pH精密試紙。

5.顯微鏡：物鏡4×或5×、10×、20×、40×，油鏡100×，目鏡10×或15×。

6.分析天平：實際分度值0.0001g。

7.培養皿：直徑90mm。

8.過濾裝置：配有砂芯濾器、圓筒形玻璃漏鬥和真空泵，抽濾壓力不低于-50kPa。

9.接種環：直徑1mm-3mm。

10.鑷子：不鏽鋼或一次性無菌塑料鑷子。

11.刻度移液管：1ml、10ml。也可使用可調式移液器。

12.量筒：100ml。

13.錐形瓶：100ml。

14.酒精燈。

15.試管：10ml。

16.無菌操作設備：無菌室、超淨工作台、生物安全櫃。

17.一般實驗室常用儀器和設備。

評價使用高溫高壓滅菌設備的滅菌效果時，取樣品瓶，加入枯草芽孢杆菌黑色變種芽孢懸液及200ml無菌水使混合液中枯草芽孢杆菌黑色變種芽孢終濃度達到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。滅菌處置完畢後，取出樣品瓶，對水樣進行滅菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色變種）的檢測。

評價使用其它滅菌設備的滅菌效果時，滅菌前取适量枯草芽孢杆菌黑色變種芽孢懸液加入滅菌設備，使水樣中枯草芽孢杆菌黑色變種芽孢終濃度達到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。滅菌處置完畢後，從滅菌設備中采集水樣，進行滅菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色變種）的檢測。采樣量一般為樣品瓶容量的80%左右，不得用樣品洗滌樣品瓶。樣品采集完畢後，迅速用無菌包裝紙包紮樣品瓶。

樣品采集後宜在2h内檢測，否則應在10℃以下冷藏保存運輸，但不得超過6h。實驗室接收樣品後，不能立即開展檢測的，樣品應在4℃以下冷藏保存，并在2h内檢測。

用無菌鑷子以無菌操作夾取無菌濾膜貼放在已滅菌的過濾裝置上，固定好過濾裝置。将樣品充分混勻後取100 ml 抽濾，以無菌水沖洗濾器内壁2-3 次。樣品過濾完成後，再抽氣約5s，關上開關。過濾前按照無菌操作要求調節樣品的pH值至7.0-8.0。

用滅菌鑷子夾取濾膜移放在酪氨酸瓊脂培養基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然後用石蠟質封口膜封好培養皿，倒置培養皿，放入恒溫培養箱内，36℃±1℃培養72h-96h。

培養96h後，如培養基上未有菌落生長，則試驗終止；如培養基上有菌落生長，則挑取黑色的特征菌落于營養瓊脂培養基上，36℃±1℃培養24h，待鑒定。同時将已挑菌落的酪氨酸瓊脂培養基培養皿儲存于2℃-5℃，以備必要時複查。

挑取黑色或可疑菌落，分别使用革蘭氏染色液和芽孢染色液染色，枯草芽孢杆菌黑色變種革蘭氏染色鏡檢以及芽孢染色鏡檢可以參考相關鏡檢圖，枯草芽孢杆菌黑色變種為革蘭氏陽性菌，營養細胞呈杆狀，單個或呈短鍊狀排列。

挑取黑色或可疑菌落，分别接種到澱粉培養基、硝酸鹽還原培養基、甘油複紅肉湯培養基、甘露糖生化培養基、甘露醇生化培養基和苦杏仁苷生化培養基上。

用無菌水按照過濾和培養步驟進行操作；培養96h後平闆培養基上應無菌落生長，否則，該次樣品鑒定結果無效，應查明原因後重新采樣和檢測。

将陰性對照菌和陽性對照菌制成濃度為40CFU/L-600CFU/L的菌懸液，分别按照過濾、培養、實驗的步驟操作。陰性、陽性對照菌呈現的生化反應結果應與參照表所列結果一緻，否則該次水樣鑒定結果無效，此時查明原因後重新采樣和檢測。

100ml水樣中檢出枯草芽孢杆菌黑色變種，即可斷定滅菌不合格；而如果在100mL水樣中未檢出枯草芽孢杆菌黑色變種，可評價為滅菌合格。