富氫水改善睡眠剝奪大鼠認知功能的實驗研究

作者：李聘、羅明珠

作者單位：西南醫科大學藥學院，軍事科學院軍事醫學研究院醫學與作業醫學研究所

營養學報2021年第43卷第3期

基金項目：“十三五”軍隊後勤科研項目重大專項

關鍵詞：睡眠剝奪、氫、認知障礙

《中國睡眠研究報告（2022）》顯示，過去10年國人的入睡時間晚了兩個多小時，睡眠平均時長從2012年的8.5小時縮減到2021年的7.06小時。調查顯示僅35%國人睡眠時間達到了8小時，新手媽媽、學生、職場人士睡眠問題突出。

睡眠問題已經成為各個年齡段、各種人群都面臨的一大問題。

睡眠剝奪是指機體因各種因素導緻部分或全部正常睡眠量喪失的狀态，簡單來說就是睡得不夠。其可導緻包括認知功能障礙在内的一系列身體機能下降，表現為焦慮、警覺性下降、反應遲緩等。由于社會競争壓力增大和生活方式的改變，多數成年人都存在着不同程度的睡眠剝奪。

睡眠剝奪會導緻學習記憶受損，工作效率下降，嚴重時甚至還可能導緻事故發生，因此，開展睡眠剝奪緻認知障礙幹 預措施的研究有着重要意義。

氫是一種小分子化合物，穿透力極強，容易穿透皮膚和黏膜進入細胞；同時，氫作為一種還原劑，參與體内氧化還原反應，可以選擇性清除體内氧自由基。

因此，氫被廣泛應用于醫學各領域的研究中。目前，常見的給氫途徑有靜脈滴注富氫生理鹽水、吸入氫和飲用氫水。但富氫生理鹽水滴注和氫吸入在日常使用中并不方便，使用受到一定限制。

相比而言，直接飲用氫水會更加便捷。研究顯示，氫能減少炎症因子的表達，提高創傷性腦損傷的存活率，發揮神經保護作用 ；也可以通過減少促炎因子的表達，降低氧化應激水平來改善抑郁症狀。另有研究表明，氫可以減輕輻射引起的認知下降和海馬損傷。

但氫能否對睡眠剝奪所緻海馬損傷具有改善作用尚未明确，鑒于氫對神經系統疾病的防治作用，本實驗拟開展氫對睡眠剝奪所緻大鼠認知障礙改善作用及機制研究，為睡眠剝奪所緻認知障礙的防治提供新的思路。

西南醫科大學藥學院，和軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所的李娉、羅明珠等在營養學報上發表了題為《富氫水改善睡眠剝奪大鼠認知功能的實驗研究》的綜述，探讨氫對睡眠剝奪認知障礙的保護作用及分子機制。

1 材 料 與 方 法

SD 大鼠 34 隻， 采用随機數字表法分為對照組（CON）、模型組 （SD）、幹預組（SD HRW），對照組 12 隻，其餘兩組各 11 隻，進行 1w 的适應性喂養。适應性喂養結束後，開始正式試驗，每日早晚 8 時灌胃， 每次 3ml，其中對照組和模型組采用純水灌胃， 幹預組采用富氫水灌胃，氫濃度為 0.8 mmol/L。 幹預第 11d 開始，進行水迷宮遊泳訓練，連續 4d， 随後建立睡眠剝奪模型，SD 組和 SD HRW 組睡眠剝奪 72h，CON 組不剝奪，建模期間仍進行幹預。

睡眠剝奪 72h 後，進行最後一次水迷宮實驗，并采用該數據作為最終成績。然後按照 0.4 ml/100g 的劑量腹腔注射 10%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹腔主動脈采血，斷頭，冰上取海馬、前額皮層。全血采用肝素鈉抗凝，10 000g，離心 1 min，收集血漿備用。該實驗獲得軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所實驗動物福利倫理委員會批準。

正式實驗 2w 後，采用多平台水環境法制備睡眠剝奪模型，水溫保持在 22℃左右，水面高出平台約 1cm。大鼠可以在平台上站立，可自由攝取食物和水，但當大鼠進入快速動眼睡眠時，由于骨骼肌松弛掉入水中而驚醒，造成睡眠剝奪，連續 72h。

利用 Morris 水迷宮訓練儀系統對大鼠的活動進行全程跟蹤。實驗室挂窗簾避光，試驗時水迷宮外所有參照物保持不變。正式實驗前 1 日，大鼠在無平台的水迷宮中自由泳 1 min，熟悉環境。

參照 Liu 等方法并進行改進。造模前 4 d 進行水迷宮學習，每天灌胃 1h 後，連續 4 d，按第Ⅰ至第Ⅳ象限順序将大鼠面壁放入水池中，每次入水間隔時間 20 min。系統自動錄像記錄大鼠入水後找到并爬上平台（停留時間＞3s）的遊泳時間，即逃避潛伏期、遊泳總路程。每次觀察時間為 60 s，如在 60 s 内動物未能找到平台，則由實驗者将其引導至平台，并在站台上停留 10 s， 潛伏期記為 60 s。逃避潛伏期越短，表明認知能力和記憶鞏固越強。剝奪 72h 後，所有大鼠進行末次定位導航實驗作為最終成績。

按照組織重量/體積=1:9 加入裂解液，制成 10%勻漿，3000 r/min 4℃離心 10 min，取上清，采用 BCA 法對組織蛋白定量。按照試劑盒說明書，檢測海馬、前額皮層中 GSH-Px、SOD、MDA 水平，海馬中 BDNF、TrkB、 IL-17 及血漿中 IL-17 水平。

随機挑選各組 6 個樣本。稱取相同體質量海馬組織後，采用 Trizol 法提取總 RNA，然後進行 qPCR 測定各樣本 BDNF、 TrkB 基因表達水平。

2 研究結果

統計學分析采用 SPSS 20.0 統計軟件進行分析。統計數據用 x ±s 表示。方差齊性檢驗後組間采用單因素方差分析檢驗。檢驗水準 α=0.05。

睡眠剝奪 72h 後，模型組大鼠的逃避潛伏期 和總路程明顯比對照組和氫幹預組長（ P ＜ 0.01），而對照組與氫幹預組之間無差異（P＞ 0.05）。

氫對大鼠海馬氧化應激水平的影響： 與對照組相比，模型組海馬中 MDA 含量明顯增加 （P ＜ 0.01），同時， GSH-Px、 SOD 表達降低 （P＜ 0.01）；與模型組相比，氫幹預組 MDA 含量明顯減少（P＜ 0.01），GSH-Px 和 SOD 表達明顯增加（P＜ 0.01）。

氫對前額皮層氧化應激水平的影響：與對照組相比，模型組前額皮層中 MDA 含量明顯增加（P＜ 0.01），GSH-Px、SOD 含量明顯減少 （P＜ 0.01）；與模型組相比，氫幹預組 MDA 含量明顯減少（P＜ 0.01），GSH-Px 和 SOD 含量明顯增加（P＜ 0.01）。

與對照組相比，模型組海馬與血漿中 IL-17 水平顯著提升（P＜ 0.01），與模型組相比，氫幹預組海馬、血漿中 IL-17 水平明顯下降（P＜ 0.01， P＜ 0.05）。

與對照組相比，模型組 TrkB 的表達明顯降低（P＜ 0.05），與模型組相比，氫幹預組表達有所升高（P＞ 0.05）；與對照組相比，模型組 BDNF 明顯降低（P＜ 0.01），與模型組相比，氫幹預組 BDNF 明顯升高（P＜ 0.01）。

與對照組相比，模型組 BDNF、TrkB 蛋白表達水平顯著降低（P＜ 0.01）；與模型組相比，氫幹預組BDNF、TrkB 水平明顯提高（P＜ 0.01）。

3 讨論

自 2007 年 Ohsawa 等報道了分子氫對大腦缺血再灌注損傷模型大鼠的治療作用後，氫的生物學作用研究受到關注。研究表明，氫可以減輕神經元損傷，延緩神經退化。研究表明，急性睡眠剝奪 24 h 或者 72 h 都會損害空間學習和認知功能 ，其導緻認知功能障礙可能與神經元損傷、突觸的可塑性降低有關。

本實驗 Morris 水迷宮結果顯示，模型組的遊泳總距離和潛伏期均明顯高于對照組，而氫幹預組的指标較模型組明顯下降，說明睡眠剝奪會降低大鼠的學習認知能力，而氫能改善海馬認知功能。

睡眠剝奪會導緻腦部的氧化應激。考慮到海馬和前額皮層在認知功能中的作用 ，本實驗結果顯示，睡眠剝奪會降低 SOD、GSH-Px 的表 達，增加 MDA 的産生，而給予氫幹預後明顯緩解， 和 Liu 等報道的結果一緻，說明氫能提高體内 抗氧化功能，降低氧化損傷，防止大分子過氧化。

研究表明，睡眠剝奪期間，血漿中 IL-1、IL-6、 IL-17 濃度顯著增加，睡眠恢複後，IL-1、IL-6 恢複正常水平，但 IL-17 仍高于正常水平，另外，IL-17 作為一種炎性因子還能通過刺激 p38 MAPK, PI3K/Akt 和 NF-κB 的激活促進其他炎症因子的表達 ，提示 IL-17 在睡眠剝奪引起的炎症反應中可能有一個關鍵性作用。

本研究顯示， 給予睡眠剝奪大鼠氫幹預後，IL-17 表達下降，說明氫能緩解睡眠剝奪引起的炎性反應，緩解大腦損傷。BDNF 是海馬含量最多的神經營養因子，參與 神經元的生長發育和突觸的可塑性調節，當 BDNF 與其特異性受體酪氨酸激酶受體 B（TrkB）結合，調節 Ca 2 水平的信号轉導途徑啟動，鈣依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表達增加，進而調節神經元的生長和發育 。

另外， BDNF 介導的 PI3K/Akt/mTOR 信号通路激活參與長時程增強和學習認知功能 。本研究檢測了海馬組織中 BDNF、TrkB 的表達，雖然氫幹預組與模型組之間沒有顯著性差異，但給予睡眠剝奪大鼠氫水後， TrkB 的轉錄水平有升高趨勢，尤其是可以顯著提高海馬組織 BDNF 的 mRNA 表達，且有統計學差異；進一步檢測表明，氫可以增加海馬的 BDNF、TrkB 在蛋白水平的表達，提示氫改善睡眠剝奪大鼠認知功能可能與增加 BDNF、TrkB 的表達有關。

4 結論

綜上，本研究建立了睡眠剝奪大鼠模型，并驗證睡眠剝奪會降低大鼠的認知功能；而氫可通過降低睡眠剝奪大鼠的炎症反應、改善其抗氧化功能及上調 BDNF、TrkB 的表達改善認知功能。但氫減緩認知功能損傷具體作用靶點及其如何在腦區發揮上調 BDNF 詳細機制還有待進一步研究。