1、故事發生在2004年,即《生化危機2》六年後,由于各新聞媒體争相報導安布雷拉公司在萊肯市的地下研究所,制作的T-病毒早前洩漏導緻陷入生化的危機。連串的負面新聞導緻公司股票價格筆直暴跌。美國聯邦政府在各國政府的壓力下暫停安布雷拉公司的業務,其後公司便宣告破産,所有地下研究中斷,T-病毒的傳播得以停止。
2、這次的主角是在《生化危機2》中到萊肯市的警察,現為美國總統直接統率的最高機密組織成員的裡昂·斯科特·肯尼迪。裡昂今次被派遣到歐洲某個(推測為西班牙或蘇格蘭)神秘村莊,受命拯救格林漢姆總統被拐去的女兒阿什莉·格林漢姆(Ashley Graham)。在拯救的途中他發現阿什莉的綁架者是一個神秘的宗教團體,名叫“Los Illuminados”(西班牙語:照亮的道路。勿與Illuminati混淆),教主是奧斯穆德·薩德勒(Osmund Saddler)。
3、進入村莊後在村莊的房間救出了一個神秘男子路易斯·賽拉(Luis Sera),就是這個時候村長比特羅斯·門德斯(Bitores Mendes)出現,裡昂跟村長交手可謂不堪一擊,裡昂及路易斯都被擊暈了。同時,奧斯穆德出現,并且在裡昂身上注射了寄生體“Las Plagas”。裡昂醒過來的時候在山谷的另一邊,從路易斯口中得知阿什莉正在被關在村内的教堂 他跟路易斯避開村民的襲擊後,路易斯便獨自逃去。裡昂回到村莊的教堂救出了阿什莉,并且利用強大武器擊倒了村長,于是離開神秘村莊,一心等待美國聯邦政府派來的直升機,但是大量村民趕到,于是裡昂帶着阿什莉進了一座古堡。
4、裡昂跟阿什莉遇上了堡主雷蒙·薩拉查(Ramon Salazar),堡主在地下礦場利用村民發掘寄生體Las Plagas并且供給Los Illuminados。在這期間,路易斯找到了能夠協助裡昂及阿什莉解開身上的寄生體的藥物及寄生體樣本,原來他曾經是Los Illuminados的研究員,然而奧斯穆德·薩德勒卻在關鍵時刻出現奪走了樣本,并把路易斯殺害。其後裡昂重遇了艾達·王,他在《生化危機2》後已經得知艾達是威斯克(Albert Wesker)派來的間諜,所以他對艾達的再次出現充滿懷疑,但被艾達逃去。裡昂始終很關心這個埋藏在心中的女子。艾什莉被薩拉查捉了及送到遙遠的有軍事設施後,裡昂擊倒了薩拉查後再次遇上艾達,艾達詢問英俊的裡昂需不需要送他一程,裡昂以尴尬的表情回答。