“我們專注于生物特異化學的研究，2018 年我們遺傳編碼了新的非天然氨基酸——氟硫酸鹽-L-酪氨酸，其反應機理正是六價硫氟交換點擊化學反應（SuFEx）[1] 。”加州大學舊金山分校教授王磊說。

　　圖 | 加州大學舊金山分校教授王磊（來源：王磊）

　　近些年，王磊專注研究的生物特異化學與點擊化學有共通之處，即都需要在溫和條件下高效反應。然而，生物特異化學需要在複雜的細胞和生物體内進行，并實現對生物分子的高選擇性，因此對反應活性和選擇性有更嚴苛的要求。

　　目前，生物特異化學主要應用于相同或不同的生物大分子。研究者通過特殊的方法使這些大分子之間發生定點和特異的反應，進行精确的共價連接。這些反應可以在體外、活細胞内與活體動物體内進行。

　　比如，應用蛋白質和蛋白質之間的生物特異反應，科學家可以在細胞内抓捕并鑒别短暫和微弱的蛋白質相互作用，用來了解酶和底物的對應關系等[2]。

　　此外，科學家也可以利用這些特異反應制備新型的共價蛋白藥物，實現更強的藥效、提高藥代性質和治療指數、減少治療劑量和給藥頻率以及降低抗藥性等[3-4]。

　　王磊說：“最近，我們主要研究蛋白質與 RNA 以及蛋白質與糖的共價連接，也稱作交聯。這些分子在反應的過程中能夠産生穩定和特異的共價連接，可以廣泛地應用于基礎生物學、合成生物學以及生物醫藥等領域。”

　　無論是蛋白質與 RNA，還是蛋白質與糖之間的交聯，都有效利用了臨近使能反應。臨近使能反應作為一種通用技術，隻在相互接觸的生物分子之間發生，有效地避免了非特異的交聯和可能帶來的副作用。同時，接觸帶來的臨近效應使得反應能夠在生物兼容的溫和條件下高效進行，适合在細胞内和活體生物内應用。

　　蛋白質與 RNA 的化學交聯

　　近日，王磊課題組在 Nature Chemistry 雜志上發表了論文《可遺傳編碼的體内 RNA 化學交聯》（Genetically encoded chemical crosslinking of RNA in vivo）[5]。

　　在本研究中，課題組将具有潛伏生物反應活性的非天然氨基酸基因編碼到 RNA 結合蛋白質中，使其與 RNA 發生反應，并在體内驗證了該方法的可行性，成功的演示出蛋白質與目标 RNA 的化學交聯。第一作者為博士後孫維（現為美國弗吉尼亞理工大學助理教授）與博士後王南溪（現為南京中醫藥大學特聘教授）。

　　（來源：Nature Chemistry）

　　在蛋白質和 RNA 的精确交聯過程中有許多技術創新之處。研究者利用上文提及的“臨近使能反應”的獨特性質，使潛伏生物反應活性的非天然氨基酸中相對惰性的官能團與 RNA 上的羟基在溫和的生物兼容條件下高效反應，同時實現對 RNA 之中核苷酸的選擇性。

　　相較于以往的分子連接技術，蛋白質與 RNA 交聯的優勢體現在：第一，所有 RNA 的核苷酸都能反應、沒有偏向性；第二，不需要額外刺激就能激發反應，可以用于細胞内和動物體内；第三，具備單個氨基酸和單個核苷酸的高分辨率。

　　為驗證蛋白質與目标 RNA 交聯的可行性與胞内适用性，課題組将非天然氨基酸遺傳編碼到“RNA 結合蛋白質”中，使其在胞内表達。蛋白質即能在胞内共價結合其目标 RNA。結合後的蛋白-RNA 複合體可以被免疫沉澱出來，獲得的 RNA 可以用标準方法進行鑒别，并能确定被交聯的核苷酸。

　　為使該交聯技術的可應用性得到擴展，研究者在蛋白質與 RNA 之間定點引入共價連接。這些共價連接可以穩定蛋白質-RNA 複合體，甚至改變其生物功能。

　　王磊說：“許多疾病都涉及到 RNA 結合蛋白質的突變。我們認為，非天然氨基酸與 RNA 的交聯對分析這些疾病機理和創建新的治療方法都會有所助益。”

　　蛋白質與糖的精确交聯

　　除了開展蛋白質與 RNA 的精确交聯實驗，王磊課題組此前還首次實現了蛋白質和糖的精确交聯[6]。

　　蛋白質和糖的相互作用在生物發育、癌症轉移、病原體感染和免疫反應等多種生物過程中都發揮出了重要的作用。

　　（來源：Nature Chemistry）

　　在蛋白質和糖精确交聯實驗中，研究者将帶有磺酰氟官能團的非天然氨基酸遺傳編碼到目标蛋白的一個位點上。當編碼蛋白與糖結合的時候，磺酰氟就會與附近糖上的羟基發生鄰近使能反應，形成特異的共價連接，把蛋白質和糖不可逆地交聯起來。

　　在此過程中，主要難點有兩個：一是糖的反應活性低，蛋白質要在生物兼容的溫和條件下與糖反應難上加難；二是各種糖的反應官能團基本相同，某個單糖的選擇性反應很難實現。

　　為克服這兩個困難，課題組采用臨近使能反應技術。該技術幫助課題組找到能在溫和條件下與糖的羟基高效反應的官能團。同時，鄰近反應的特點又巧妙地解決了單糖的選擇性。

　　總之，蛋白質和糖的精确交聯能夠在蛋白質和碳水化合物之間引入共價鍵，解決兩種分子長期以來親和力低、内部關系弱的問題。因此，蛋白質和糖的交聯能夠促進糖生物學的基礎研究進步，并開發出靶向多糖診斷和治療的創新途徑。

　　王磊課題組在 2013 年首次提出了鄰近使能反應的概念，并實現了在蛋白質中引入新的共價鍊接[7-8]。這些共價鍊接已用于提高蛋白質的各種性能，例如穩定性、活性、和光學響應等[9]。

　　在最新的工作中，他們把這種共價鍊接從蛋白質-蛋白質擴展到了蛋白質-RNA 和蛋白質-糖，證明了鄰近使能反應概念對生物分子的通用性。

　　參考資料：

　　1. Wang, N., Yang, B., Fu, C., Zhu, H., Zheng, F., Kobayashi, J., Liu J., Li, S., Cheng, M., Wang, P. G., Wang, Q., Wang, L. Genetically encoding fluorosulfate-L-tyrosine to react with lysine, histidine and tyrosine via SuFEx in protein in vivo. J. Am. Chem. Soc. 140(15):4995-4999 (2018).

　　2. Yang, B., Tang, S., Ma, C., Li, S. T., Shao, G. C., Dang, B., DeGrado, W. F., Dong, M. Q., Wang, P. G., Ding, S., Wang, L. Spontaneous and specific chemical crosslinking in live cells to capture and identify protein interactions. Nat. Comm. 8:1-10 (2017).

　　3. Li, Q., Chen, Q., Klauser, P. C., Li, M., Zheng, F., Wang, N., Li, X., Zhang, Q., Fu, X., Wang, Q., Xu, Y., Wang, L.Developing Covalent Protein Drugs via Proximity-Enabled Reactive Therapeutics. Cell 182(1): 85-97 (2020).

　　4. Yu, B.; Li, S.; Tabata, T.; Wang, N.; Cao, L.; Kumar, G. R.; Sun, W.; Liu, J.; Ott, M. M.; and Wang, L.Accelerating PERx Reaction Enables Covalent Nanobodies for Potent Neutralization of SARS-Cov-2 and Variants. Chem 8: 2766-2783 (2022).

　　5. Sun, W.; Wang, N.; Liu, H.; Yu, B.; Jin, L.; Ren, X.; Shen, Y.; and Wang, L. Genetically encoded chemical crosslinking of RNA in vivo. Nat. Chem. doi: 10.1038/s41557-022-01038-4 (2022).

　　6.Li, S.; Wang, N.; Yu, B.; Sun, W.; and Wang, L. Genetically encoded chemical crosslinking of carbohydrate. Nat. Chem. in press, DOI: 10.1038/s41557-022-01059-z (2022)

　　7. Xiang Z, Ren H, Hu YS, Coin I, Wei J, Cang H, Wang L. Adding an unnatural covalent bond to proteins through proximity-enhanced bioreactivity.Nat. Methods. 2013，10(9):885-8.

　　8. Coin I, Katritch V, Sun T, Xiang Z, Siu FY, Beyermann M, Stevens RC, Wang L. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 2013， 5; 155(6):1258-69.

　　9. Cao, L.; Wang, L. New Covalent Bonding Ability for Proteins. Protein Sci. 31: 312-322 (2022).

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